活細胞 Hep G2 培養箱內熒光動態觀察分析實驗方案與關鍵技術解析

Hep G2 細胞（人肝癌細胞系）是肝臟代謝、藥物毒性評估及腫瘤研究的經典模型，在培養箱內開展活細胞熒光動態觀察，可實時捕捉細胞生理狀態（如增殖、凋亡、代謝活性）、分子事件（如信號通路激活、蛋白定位）的動態變化，避免傳統 “終點檢測" 因細胞脫離培養環境導致的誤差。以下從實驗設計、關鍵操作、數據分析及常見問題解決四方面，系統梳理該實驗的核心要點。

一、實驗設計核心要素

1. 實驗目的與熒光標記策略

需先明確動態觀察的核心目標，再針對性選擇熒光探針或標記方法，確保標記特異性、低毒性及與 Hep G2 細胞特性的匹配性。

2. 實驗分組與對照設置

Hep G2 細胞實驗需嚴格設置對照，排除熒光干擾、環境波動及探針本身的影響，常見分組如下：

空白對照：僅 Hep G2 細胞 + 培養基，無任何熒光標記，用于檢測背景熒光（如培養基自發熒光、細胞 autofluorescence）。

陰性對照：Hep G2 細胞 + 熒光探針（無處理因素），用于確認探針特異性（如無目標分子時的熒光強度）。

陽性對照：Hep G2 細胞 + 已知作用的處理劑 + 熒光探針（如觀察凋亡時用 10μM 順鉑處理，觀察增殖時用 10% FBS 刺激），用于驗證實驗體系有效性。

實驗組：Hep G2 細胞 + 待測試處理（如藥物濃度梯度、缺氧條件、細胞因子）+ 熒光探針，根據實驗目的設置 3-5 個生物學重復。

3. 時間序列與觀察參數設定

根據觀察目標確定時間間隔（Δt）和總觀察時長（T），避免因間隔過長遺漏關鍵事件，或過短導致細胞應激（如反復光照）：

短期觀察（數小時至 1 天）：如信號通路激活（如 NF-κB 核轉位，響應時間 30min-6h），時間間隔設為 15-30min，總時長 6-12h。

中期觀察（1-7 天）：如細胞增殖、藥物毒性（如 IC50 檢測），時間間隔設為 2-4h，總時長 3-7 天（需注意培養基更換，避免營養耗盡）。

長期觀察（7-14 天）：如細胞分化、腫瘤球形成，時間間隔設為 6-12h，總時長 7-14 天（需使用抗蒸發培養皿，定期補充培養基）。

同時固定熒光激發光強度（Ex）、發射光濾光片（Em）、曝光時間（通常 100-500ms），避免因光強過高導致光毒性（如活性氧產生、細胞凋亡）或熒光淬滅。

二、實驗關鍵操作步驟

1. 前期準備：細胞預處理與熒光標記

Hep G2 細胞復蘇與傳代：

從液氮中復蘇 Hep G2 細胞，用含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 高糖培養基培養，置于 37℃、5% CO?培養箱中，待細胞融合度達 70%-80% 時傳代（傳代比例 1:3），確保實驗用細胞處于對數生長期（活力 > 95%，臺盼藍染色檢測）。

細胞接種與貼壁：

選擇適配活細胞成像的培養皿 / 板（如玻璃底培養皿、96 孔玻璃底微孔板），用 PBS 清洗 2 次后，將 Hep G2 細胞以 1×10?-5×10? cells/cm2 的密度接種（確保觀察時細胞不重疊，便于單個細胞追蹤），置于培養箱中孵育 24h，待細胞貼壁。

熒光標記（非病毒轉染類）：

按探針說明書配制工作液（如 CFSE 用 DMSO 溶解后，用培養基稀釋至終濃度 5μM），吸棄舊培養基，加入熒光探針工作液，37℃孵育 15-30min（具體時間參考探針說明）。

孵育后用預熱的 PBS 清洗細胞 2-3 次，去除未結合的游離探針，加入新鮮預熱的培養基，避免探針殘留導致的背景熒光干擾。

2. 成像系統搭建與環境控制

核心設備：活細胞成像培養箱（如 Olympus CellVivo、Zeiss Incubator XL），需具備以下功能：

精準控溫（37±0.5℃）：避免溫度波動導致 Hep G2 細胞代謝紊亂（如低溫抑制增殖，高溫誘導凋亡）。

CO?濃度控制（5±0.1%）：維持培養基 pH 穩定（DMEM 培養基含 NaHCO?，需 CO?平衡 pH 至 7.2-7.4）。

濕度控制（>95%）：防止培養基蒸發導致滲透壓升高，可使用抗蒸發蓋或添加無菌水至培養箱托盤。

成像模塊：配備熒光顯微鏡（如 confocal 共聚焦顯微鏡，減少雜散光；或寬場顯微鏡，提高成像速度）、高靈敏度相機（如 sCMOS 相機，捕捉弱熒光信號）及自動載物臺（實現多視野同時觀察）。

3. 動態觀察與數據采集

預觀察與焦點校準：

實驗開始前，在明場下確認 Hep G2 細胞狀態（無漂浮、形態正常），選擇 3-5 個代表性視野（避免邊緣區域，細胞分布均勻），用熒光通道預覽熒光信號強度，調整焦距至細胞清晰（建議使用 “Z-stack" 功能，選擇細胞中層平面，避免聚焦在培養基表面或培養皿底部）。

啟動時間序列采集：

在成像軟件（如 Olympus CellSens、Zeiss ZEN）中設置參數：時間間隔、總時長、熒光通道順序（建議先采集弱熒光通道，再采集強熒光通道，避免串色）、每個視野的圖像數量（如每個視野采集 5-10 層 Z-stack，用于后續 3D 重構）。

采集過程中避免打開培養箱門，如需更換培養基（長期觀察），需在超凈臺內快速操作（<5min），并提前將新培養基預熱至 37℃，避免溫度沖擊。

數據存儲：

選擇無損格式存儲圖像（如 TIFF、CZI 格式），記錄每個樣本的元數據（如處理條件、熒光探針濃度、成像參數），避免因數據格式壓縮導致信息丟失。

三、數據分析流程與指標解讀

數據預處理：排除干擾與圖像優化

背景扣除：使用軟件自帶工具（如 ImageJ 的 “Subtract Background" 功能），減去空白對照的背景熒光，降低培養基自發熒光、探針殘留的影響。

圖像對齊：長期觀察中可能因培養箱震動導致視野偏移，用 “Image Registration" 工具（如 ImageJ 的 StackReg 插件）對齊時間序列圖像，確保同一細胞可被追蹤。

熒光淬滅校正：若觀察時長超過 24h，熒光信號可能因光漂白下降，可通過陽性對照的熒光強度變化建立校正曲線，對實驗組信號進行歸一化（如將各時間點熒光強度除以初始時間點強度，得到相對熒光強度）。

通過以上實驗設計與操作，可實現 Hep G2 細胞在生理培養條件下的熒光動態觀察，精準捕捉細胞增殖、凋亡、分子事件的實時變化，為肝臟疾病機制研究、藥物篩選提供高時空分辨率的數據支持。