相差 - 熒光活細胞顯微時間序列動態觀察，是將相差顯微鏡技術與熒光顯微鏡技術結合，對活細胞進行長時間、周期性的動態成像記錄，從而實時追蹤細胞形態變化、亞細胞結構動態及分子表達 / 定位等過程的前沿顯微成像方法。該技術既解決了活細胞無標記觀察的需求，又實現了特異性分子靶向追蹤，是細胞生物學、發育生物學、藥理學等領域研究活細胞動態行為的核心手段。

一、核心技術原理：相差與熒光的 “互補協作"

該技術的核心是兩種顯微技術的協同 —— 相差技術負責 “無標記看形態"，熒光技術負責 “特異性看分子"，二者結合實現活細胞動態的 “全景 + 精準" 觀察。

1. 相差顯微鏡技術：無標記觀察活細胞形態

活細胞通常透明（折射率與周圍培養基差異?。?，普通明場顯微鏡難以分辨細節。相差技術通過將細胞內部折射率差異轉化為明暗對比，無需染色即可觀察活細胞的形態、運動及內部結構（如細胞核、線粒體、細胞膜邊緣），避免了染色對細胞活性的破壞。

關鍵原理：利用光的 “相位差"（光穿過細胞不同結構時，因折射率不同導致傳播速度差異，產生相位差），通過顯微鏡內的 “相差板" 將不可見的相位差轉化為可見的 “振幅差"（明暗差異），使透明細胞呈現清晰的明暗對比圖像。

優勢：無標記、不損傷細胞，可長期觀察細胞存活狀態；適合觀察細胞貼壁、遷移、分裂等宏觀動態行為。

2. 熒光顯微鏡技術：特異性追蹤分子 / 亞細胞結構

熒光技術通過 “熒光探針"（如熒光染料、熒光蛋白）與細胞內特定靶點（如 DNA、蛋白質、細胞器膜）特異性結合，在激發光照射下探針發出熒光，從而實現對目標結構的精準定位和動態追蹤。

關鍵原理：基于 “熒光現象"—— 熒光探針吸收特定波長的激發光后，電子躍遷到高能級，再回到基態時釋放出波長更長的熒光；顯微鏡通過 “激發濾光片"（篩選激發光）、“ dichroic 鏡"（反射激發光、透過熒光）和 “發射濾光片"（篩選熒光），僅采集目標熒光信號，排除背景干擾。

常用探針舉例：

細胞核標記：DAPI（結合 DNA，發藍色熒光）；

細胞骨架標記：Alexa Fluor 488 - 鬼筆環肽（結合肌動蛋白，發綠色熒光）；

分子表達追蹤：GFP（綠色熒光蛋白，融合到目標蛋白上，實現動態定位）。

3. 時間序列成像：動態記錄細胞行為

通過顯微鏡的自動控制模塊（如電動載物臺、自動聚焦、快門控制），按設定的時間間隔（如每 5 分鐘、每 1 小時）對同一視野的細胞進行連續成像，生成 “時間序列圖像棧" 或動態視頻。結合圖像分析軟件（如 ImageJ、MetaMorph），可量化分析細胞遷移速度、分裂周期、熒光信號強度變化等參數。

二、核心應用場景：聚焦 “活細胞動態過程"

該技術因能兼顧 “無損傷" 與 “特異性"，廣泛應用于需實時追蹤細胞動態的研究領域：

應用領域具體研究方向技術價值

細胞生物學細胞分裂周期追蹤、細胞遷移 / 侵襲、細胞凋亡動態無標記觀察分裂形態，同時用熒光標記染色體（如 H2B-GFP），精準定位分裂階段

發育生物學早期胚胎發育（如斑馬魚 / 線蟲胚胎細胞分化）、干細胞分化動態長期記錄胚胎細胞增殖分化過程，熒光標記分化標志物（如 Oct4、Sox2）

藥理學藥物對細胞的動態影響（如藥物誘導的細胞骨架重組、凋亡過程）實時觀察藥物作用下細胞形態變化，同時用熒光探針檢測凋亡信號（如 Annexin V）

分子生物學蛋白質定位與轉運（如膜蛋白內吞、細胞器間物質交換）熒光標記目標蛋白，追蹤其在細胞內的動態移動路徑

病毒學病毒入侵宿主細胞的過程（如新冠病毒與細胞膜結合、病毒顆粒在細胞內擴散）熒光標記病毒顆粒（如 GFP 標記病毒衣殼蛋白），實時記錄入侵步驟

三、關鍵技術挑戰與解決方案

活細胞長時間成像需克服 “細胞存活" 與 “成像質量" 的矛盾，核心挑戰及應對策略如下：

1. 細胞活性維持：避免成像過程損傷細胞

長時間成像（數小時至數天）中，光照、溫度、CO?濃度等均可能影響細胞存活，需通過 “環境控制模塊" 解決：

溫度控制：顯微鏡載物臺配備加熱板 / 加熱套，維持 37℃（哺乳動物細胞）恒溫，避免溫度波動導致細胞代謝紊亂；

氣體控制：內置 CO?培養小室（通入 5% CO?），維持培養基 pH 穩定（避免 pH 變化導致細胞凋亡）；

濕度控制：小室加裝濕度模塊，防止培養基蒸發導致滲透壓升高；

光毒性抑制：

選擇 “低光毒性熒光探針"（如 GFP 變體 mNeonGreen，比傳統 GFP 更亮，可降低激發光強度）；

采用 “脈沖式激發"（縮短激發光照射時間，如每次照射 10-50ms），減少光對細胞的氧化損傷；

優先用相差成像記錄形態，僅在關鍵時間點啟動熒光成像。

2. 成像穩定性：避免長時間成像的 “漂移"

長時間成像中，載物臺位移、焦距偏移（如培養基蒸發導致液面下降）會導致圖像模糊，需通過 “自動校正模塊" 解決：

自動聚焦（Auto-focus）：基于 “對比度檢測" 或 “激光反射聚焦"，每次成像前自動調整物鏡焦距，確保細胞始終處于焦平面；

自動載物臺校正（Auto-stage correction）：通過圖像中 “參考標記"（如培養皿邊緣、固定的細胞結構），實時校正載物臺的 X/Y 軸位移；

使用高穩定性載物臺：采用無振動的電動載物臺，避免環境振動（如實驗室人員走動）對成像的影響。

3. 圖像信噪比：排除背景干擾，清晰捕捉信號

活細胞成像中，背景熒光（如培養基自發熒光、細胞 autofluorescence）會影響信號質量，需通過 “光學優化 + 軟件處理" 解決：

光學層面：

使用 “高數值孔徑（NA）物鏡"（如 NA 1.4 的油鏡），提高熒光信號采集效率；

搭配 “共聚焦掃描模塊"（可選升級），通過針孔排除焦外熒光，顯著提升信噪比（適合厚樣本或高背景場景）；

軟件層面：

成像后用軟件（如 ImageJ）進行 “背景扣除"“平滑濾波"，減少噪聲干擾；

對時間序列圖像進行 “配準"，校正微小位移導致的信號偏移。

四、典型實驗流程示例（以 “細胞遷移追蹤" 為例）

樣本制備：將待觀察細胞（如 HeLa 細胞）接種到 “玻璃底培養皿"（適配顯微鏡載物臺，保證光學清晰度），加入含血清的培養基，置于 37℃、5% CO?培養箱中貼壁生長至 50%-70% 融合度；

熒光標記（可選）：若需標記特定結構（如細胞骨架），加入熒光探針（如 Alexa Fluor 488 - 鬼筆環肽），37℃孵育 20 分鐘，用 PBS 洗去未結合探針，加入新鮮培養基；

顯微鏡 setup：將培養皿放入顯微鏡的 “環境控制小室"，設定溫度 37℃、CO?濃度 5%，等待 10 分鐘讓細胞適應環境；

視野選擇與參數設定：

在明場 / 相差模式下找到目標視野（選擇細胞分布均勻、無明顯雜質的區域）；

設定成像模式：同時采集 “相差圖像"（記錄細胞形態）和 “熒光圖像"（記錄細胞骨架）；

設定時間序列參數：成像間隔 10 分鐘，總成像時間 12 小時（共 72 個時間點），每個視野拍攝 3 個 Z 軸層面（避免焦距漂移）；

啟動成像：開啟自動成像程序，期間避免觸碰顯微鏡或實驗臺，防止振動；

數據分析：

用 ImageJ 導入時間序列圖像棧，進行背景扣除、Z 軸投影（取最清晰層面）；

使用 “細胞追蹤插件"（如 TrackMate）標記單個細胞，計算細胞遷移軌跡、遷移速度、方向角等參數；

結合熒光信號強度分析，觀察細胞遷移過程中細胞骨架的動態變化（如絲狀偽足的伸出與收縮）。

綜上，相差 - 熒光活細胞顯微時間序列動態觀察技術，通過 “無標記 + 特異性標記" 的協同優勢，為活細胞動態行為研究提供了高時空分辨率的可視化工具，其核心是在 “細胞存活" 與 “成像質量" 之間找到平衡，同時依賴精準的環境控制和后期數據分析，才能充分發揮其在生命科學研究中的價值。