使用奧林巴斯 CX33 顯微鏡進行熒光觀察顆粒樣品（如熒光標記的化妝品顆粒、生物微粒等），需結合其硬件特性與熒光成像原理，以下是具體操作流程及注意事項：

一、樣品預處理（針對顆粒樣品）

分散與富集

若顆粒團聚，超聲處理 1-2 分鐘（功率≤50W）使其均勻分散；

微米級顆粒：通過 0.45μm 濾膜過濾，將顆粒截留于膜表面，提高觀察密度；

納米顆粒：可選負染色法（2% 磷鎢酸）增強對比度，或直接利用表面修飾的熒光基團（如羅丹明 B 標記）。

熒光標記

無熒光顆粒：用對應激發波長的熒光染料染色（如綠色熒光選 FITC，紅色選 Cy3）；

標記后需清洗去除游離染料，避免背景干擾。

二、設備配置與參數設置

熒光附件安裝

插入緊湊型熒光照明器（需額外配置），LED 光源預對中，無需手動校準；

聚光鏡切換至FL（熒光）位置，阻擋透射光，減少背景雜光。

濾光片選擇（根據熒光類型）

綠色熒光顆粒（如 FITC、GFP）：藍光激發（BP470-490nm），發射光 BP510-550nm；

紅色熒光顆粒（如羅丹明、Cy3）：綠光激發（BP530-550nm），發射光 BP570-620nm；

若為多色標記，需依次單通道采集，避免串色。

光源與光闌調節

LED 光源強度調至 50%-70%（延長熒光壽命，避免淬滅）；

孔徑光闌縮小至 50%-70%（增強對比度，減少散射光）。

三、熒光觀察操作步驟

低倍鏡定位（4X/10X）

明場下找到顆粒密集區域，記錄坐標；

切換熒光通道，觀察熒光分布（如脂質體顆粒可能邊緣熒光增強）。

高倍鏡精細觀察（40X/100X 油鏡）

100X 油鏡需滴加香柏油，微調焦至顆粒邊緣清晰（避免壓碎玻片，工作距離 0.13mm）；

觀察形態（球形 / 片狀）、熒光均勻性（如納米顆粒是否團聚導致熒光聚集）。

動態或三維觀察（可選）

若需時間序列成像，開啟 LED 低光毒性模式（減少光損傷）；

配合 CellSens 軟件進行 Z-stack 掃描，重建顆粒三維分布（需載物臺高精度升降）。

四、圖像優化與分析

對比度增強

柯勒照明下調節聚光鏡高度，確保光斑均勻覆蓋視野；

暗場模式輔助觀察透明顆粒的熒光散射（需暗場聚光鏡附件）。

量化分析

粒徑測量：CellSens 或 ImageJ 標尺功能，統計≥100 個顆粒的 D10/D50/D90；

熒光強度：標準化背景后，分析單顆粒或區域平均強度（反映標記效率）；

形態分類：球形度、長寬比等參數，區分團聚與分散狀態。

多模態聯用

白光 + 熒光疊加成像，定位熒光顆粒的物理位置；

結合偏光模式，分析礦物顆粒的雙折射（如二氧化鈦的晶型差異）。

五、注意事項

防熒光淬滅：快速拍照，避免長時間激發；可添加抗淬滅劑（如 DABCO）。

載玻片選擇：使用薄型蓋玻片（0.17mm），避免光路偏差；熒光樣品需避光保存。

物鏡維護：油鏡使用后及時用二甲苯擦拭，防止香柏油殘留影響透光率。

環境控制：關閉室內光源，減少雜散光；空調控溫（25℃±1℃），避免熱漂移。

總結

奧林巴斯 CX33 通過LED 熒光照明 + UIS2 光學系統，可實現顆粒樣品的高對比度熒光觀察，尤其適合微米級熒光標記顆粒的形態分析與定量研究。結合樣品預處理（分散 / 染色）、濾光片精準匹配及軟件分析，能有效支撐化妝品、生物醫學等領域的顆粒表征需求。

（注：CX33 需選配熒光模塊，基礎機型僅支持明場 / 暗場，升級后可實現藍激發熒光觀察。）