奧林巴斯 CKX53 倒置熒光顯微鏡觀察植物細胞的操作指南與應用

一、顯微鏡系統特性與植物細胞觀察優勢

奧林巴斯 CKX53 作為倒置熒光顯微鏡，其物鏡向上聚焦的設計適合觀察貼壁或懸浮的植物細胞（如原生質體、愈傷組織細胞），搭配熒光模塊可實現 GFP、RFP 等標記蛋白的亞細胞定位觀察，或自發熒光物質（如葉綠素、木質素）的可視化。其核心優勢包括：

長工作距離物鏡：4X/10X/20X 物鏡工作距離≥10mm，適合厚樣本（如葉片切片、莖段橫切）或培養皿內活細胞觀察，避免物鏡碰撞樣本；

模塊化熒光系統：支持 U-MWU2（藍光，激發 GFP）、U-MWG2（綠光，激發 RFP）等濾塊，匹配植物常用熒光探針；

活細胞培養兼容：可外接 CO?培養箱或加熱臺，維持植物細胞生理狀態（如 25℃恒溫培養）。

二、植物細胞樣本制備關鍵步驟

1. 原生質體與懸浮細胞制備

酶解分離：葉片經 0.5% 纖維素酶 + 0.1% 果膠酶 30℃酶解 2-4h，過濾離心獲得原生質體，用 W5 緩沖液重懸后滴加至載玻片，加蓋玻片時避免氣泡（氣泡會導致熒光淬滅）；

懸浮細胞系：如煙草 BY-2 細胞，取對數生長期細胞（密度 1×10? cells/mL），直接滴加 100μL 于玻璃底培養皿（MatTek dish），靜置 5min 使細胞貼壁。

2. 組織切片與固定樣本

徒手切片：葉片或莖段用刀片快速切片（厚度≤50μm），置于載玻片水滴中，如需觀察細胞壁木質素自發熒光，可直接封片；

固定染色：細胞骨架觀察需先用 4% 多聚甲醛固定 15min，透化后用鬼筆環肽 - Alexa Fluor 488 標記肌動蛋白，DAPI 染色細胞核（激發波長 365nm，需 U-MNUA 濾塊）。

三、熒光觀察操作流程與參數優化

1. 顯微鏡硬件設置

光源與濾塊選擇：

熒光類型激發濾光片發射濾光片適用探針 / 自發熒光

綠色熒光（GFP）BP470-490nmBP510-550nmGFP、葉綠素自發熒光（弱）

紅色熒光（RFP）BP530-550nmBP570-620nmmCherry、葉綠素自發熒光

紫外激發（DAPI）BP330-385nmBP420nm+細胞核染色、木質素自發熒光

物鏡匹配：觀察原生質體中熒光蛋白分布用 20X/0.45 物鏡（工作距離 10.6mm），亞細胞結構（如葉綠體熒光）需 40X/0.60 物鏡（工作距離 5.3mm），避免高倍鏡（100X）因穿透深度不足導致信號丟失。

2. 成像參數優化

曝光時間控制：葉綠素自發熒光較強，曝光≤50ms 避免飽和；GFP 標記蛋白需 100-300ms，開啟 EM 增益（如 1.5×）提升弱信號；

Z 軸層掃設置：細胞厚度約 10-20μm，層間距設為 1μm，共掃 15-20 層，后期用 Volocity 軟件三維重建（如觀察液泡中蛋白分布）；

背景扣除：拍攝無樣本的空白視野作為背景，用 ImageJ 的 “Subtract Background" 功能（半徑 50px）消除非特異性熒光。

四、典型應用場景與觀察要點

1. 葉綠體動態與蛋白定位

觀察方法：轉染 GFP-TOC33（葉綠體膜蛋白）的煙草葉片原生質體，用 U-MWU2 濾塊觀察，可見綠色熒光環繞的類囊體結構，結合 DIC 明場可疊加葉綠體形態（橢圓狀，長徑 5-8μm）；

動態追蹤：開啟延時攝影（間隔 5min，共 2h），記錄葉綠體在光誘導下的遷移（速度約 1-2μm/min），用 TrackMate 插件分析軌跡。

2. 細胞壁木質化與自發熒光

樣本制備：擬南芥莖段徒手切片，直接置于載玻片，用 U-MNUA 濾塊（紫外激發）觀察，木質化導管呈現藍色自發熒光（420nm 發射），可通過熒光強度量化木質素沉積量（如突變體 vs 野生型）；

定量分析：用 LAS 軟件圈選導管區域，計算平均熒光強度（A.U.），結合 Wiesner 試劑染色（間苯三 + HCl，紅色顯色）驗證木質素分布一致性。

3. 細胞分裂與骨架動態

微管標記：轉染 Tubulin-RFP 的 BY-2 細胞，用 U-MWG2 濾塊觀察，前期可見紅色熒光組成的早前期帶，末期形成成膜體（桶狀結構，直徑約 3μm）；

3D 重建：Z-stack 層掃（0.5μm 間隔）后用 Imaris 軟件重建微管網絡，測量紡錘體長度（中期約 10μm）及極間距離變化。

五、數據采集與分析規范

1. 多通道同步采集

同時開啟 DIC 明場與熒光通道，明場用于定位細胞輪廓，熒光通道標記目標結構，避免單一熒光通道導致的定位偏差（如 GFP 信號可能重疊于細胞壁或細胞核）；

示例：拍攝保衛細胞中 ABA 誘導的鈣信號（Fluo-4 染色），需同步采集 488nm 熒光（鈣信號）與 561nm 熒光（葉綠素自發熒光），用顏色疊加區分細胞質與葉綠體區域。

2. 定量分析工具與指標

熒光強度量化：

單細胞水平：用 CellProfiler 軟件識別細胞邊界，計算單個細胞內熒光蛋白的平均強度（如細胞核中 GFP-H2B 的強度反映組蛋白含量）；

亞細胞結構：在葉綠體區域畫 ROI，用 ImageJ 的 “Measure" 功能計算類囊體熒光均一性（CV 值，變異系數≤15% 為均一分布）；

動態參數提取：

顆粒運動：如胞吞小泡（直徑 0.5-1μm）的遷移速度，用 MTrackJ 插件追蹤，正常細胞中速度約 0.3-0.8μm/s；

振蕩分析：如氣孔運動中保衛細胞的鈣振蕩，記錄熒光強度 - 時間曲線，用 Fast Fourier Transform 分析周期（通常 5-15min / 周期）。

六、常見問題與解決方案

問題現象可能原因解決方案

熒光信號弱或無濾塊選擇錯誤 / 樣本降解核對激發 - 發射波長匹配性，新鮮制備樣本并避免固定劑過度處理（如多聚甲醛≤30min）

圖像模糊有重影樣本厚度不均 / 物鏡污染切片厚度≤30μm，用鏡頭紙蘸無水乙醇擦拭物鏡前透鏡（避免劃傷）

葉綠素自發熒光過強曝光時間過長縮短曝光至 50ms 以下，或在光路中加入 ND2 中性密度濾光片（降低 50% 光強）

活細胞觀察中細胞死亡溫度 / 滲透壓失衡外接加熱臺維持 25℃，原生質體懸浮液中添加 0.4M 甘露醇維持滲透壓

七、進階技術與前沿應用

光片熒光顯微（Light Sheet）：CKX53 可升級光片模塊（如 FlipSPIM），對擬南芥根尖分生區進行三維動態成像（光毒性降低 80%），追蹤干細胞分裂周期（約 12h）；

FRAP（光漂白熒光恢復）：用 405nm 激光漂白 GFP 標記的細胞膜蛋白，通過恢復曲線計算蛋白流動性（擴散系數 D，膜蛋白 D≈10?? cm2/s）；

AI 輔助分析：使用 DeepCell 算法自動分割復雜組織中的植物細胞（如葉片葉肉細胞與維管束細胞），分割準確率達 92% 以上。

通過奧林巴斯 CKX53 倒置熒光顯微鏡的精準操作與定量分析，可在單細胞及亞細胞水平解析植物細胞的生理過程、蛋白互作及環境響應機制，為植物分子生物學與生物技術研究提供可視化與數據支撐。