在DC（樹突狀細胞）與T細胞共培養體系中，免疫突觸的形成是觀察兩者相互作用的核心指標，其觀察需結合熒光標記、成像技術及功能驗證，以下從關鍵步驟、技術選擇及實驗優化三方面展開說明：

一、關鍵步驟：共培養體系設計與熒光標記

細胞來源與純化

DC：常用骨髓來源DC（BMDC）或單核細胞誘導的MoDC（如人外周血CD14?單核細胞經GM-CSF+IL-4誘導）。

T細胞：從同一供體分離CD4?或CD8? T細胞（如通過陰性選擇磁珠分選），純度需＞90%以減少非特異性干擾。

共培養條件：DC與T細胞比例通常為1:5至1:20，共培養時間6-24小時（突觸形成高峰期），可添加抗原肽（如OVA???????）或TLR配體（如LPS）誘導DC成熟。

熒光標記策略

DC標記：

膜標記：CD11c-APC（DC特異性標志）、MHC II-PE（抗原呈遞能力）。

功能標記：CD80-FITC/CD86-FITC（共刺激分子，成熟標志）。

T細胞標記：

膜標記：CD3-CFSE（追蹤增殖）、CD4-Pacific Blue/CD8-PerCP（亞群區分）。

功能標記：p-ZAP70-Alexa Fluor 647（T細胞活化信號）、LFA-1-Alexa Fluor 555（黏附分子）。

細胞骨架標記：Phalloidin-iFluor 555（標記DC和T細胞的F-actin，觀察突觸處骨架重排）。

二、技術選擇：成像方法對比與推薦

共聚焦顯微鏡

優勢：高分辨率（0.2 μm），可清晰顯示突觸處MHC-TCR、LFA-1-ICAM-1等分子對的聚集。

參數設置：

激光功率：＜5%（避免光毒性）。

針孔大小：1 Airy單位（平衡分辨率與信噪比）。

Z軸步進：0.5 μm（覆蓋DC偽足高度）。

案例：觀察DC與OT-II T細胞共培養時，MHC II與TCR在突觸處的共定位（Pearson相關系數＞0.7）。

成像流式細胞術（MIFC）

優勢：高通量（每小時分析10?細胞），可量化突觸形成比例及信號強度。

設門策略：

聚焦細胞：根據“gradient RMS"特征選擇。

偶聯體識別：CFSE?（T細胞）與CD11c?（DC）雙陽性細胞。

Interface Mask：定義T-DC接觸界面，統計該區域phalloidin或LFA-1熒光強度。

案例：研究顯示，抗原呈遞后DC與T細胞突觸形成比例從15%升至45%（p＜0.01）。

活細胞工作站

優勢：動態追蹤突觸形成過程（時間間隔5-30分鐘）。

關鍵配置：

環境控制：37℃、5% CO?、飽和濕度。

防漂移設計：硬件自動聚焦（如Perfect Focus System）。

案例：實時觀察DC偽足與T細胞接觸后，p-ZAP70在接觸區快速聚集（＜5分鐘）。

三、實驗優化：減少干擾與提高可重復性

降低自發熒光

培養基：使用無酚紅RPMI-1640（避免488 nm激發下酚紅熒光干擾）。

耗材：采用低自發熒光玻璃底培養皿（如Corning 35 mm #1.5 coverglass）。

標記條件優化

抗體濃度：通過滴定實驗確定最佳濃度（如CD80-FITC：1 μg/10? cells）。

標記時間：

膜抗體：冰上標記30分鐘（減少內吞導致的非特異性結合）。

細胞骨架探針：37℃標記15分鐘（確保phalloidin進入活細胞）。

功能驗證

陰性對照：未標記組（背景熒光）和同型抗體對照組。

陽性對照：使用已知陽性細胞（如LPS刺激后的DC與T細胞共培養）。

重復驗證：至少3次獨立實驗，每次3個技術重復。

四、典型結果與分析

突觸形成標志

形態學：DC偽足與T細胞接觸，形成“牛眼樣"結構（中心為MHC-TCR，外周為LFA-1-ICAM-1）。

量化數據：成像流式顯示，抗原呈遞組突觸界面phalloidin熒光強度較未處理組高3倍（p＜0.001）。

功能關聯

T細胞活化：突觸形成比例與T細胞IL-2分泌量呈正相關（r=0.85, p＜0.01）。

DC成熟：LPS刺激后DC與T細胞突觸形成效率提升50%，伴隨CD80/CD86表達上調。

五、技術局限性及解決方案

共聚焦顯微鏡：

問題：光毒性限制長時間觀察。

解決：使用低功率激光（＜5%）或光活化熒光蛋白（如PA-GFP）。

成像流式：

問題：偶聯體識別可能受細胞重疊干擾。

解決：結合“aspect ratio"和“area"參數排除非特異性雙陽性細胞。